大有讲究的“小型蛋白”反相层析
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- 发布时间：2017-10-12 00:00
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多肽是由多个氨基酸通过肽键连接而形成的一类化合物，通常由10~100个氨基酸分子组成，其连接方式与蛋白质相同，相对分子质量低于10000，小编姑且称其为“小众蛋白”。多肽普遍存在于生物体内，迄今在生物体内发现的多肽已达数万种，其广泛参与和调节机体内各系统、器官、组织和细胞的功能活动，在生命活动中发挥重要作用。
大有讲究的“小型蛋白”反相层析
多肽是由多个氨基酸通过肽键连接而形成的一类化合物，通常由10~100个氨基酸分子组成，其连接方式与蛋白质相同，相对分子质量低于10000，小编姑且称其为“小众蛋白”。多肽普遍存在于生物体内，迄今在生物体内发现的多肽已达数万种，其广泛参与和调节机体内各系统、器官、组织和细胞的功能活动，在生命活动中发挥重要作用。
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多肽是由多个氨基酸通过肽键连接而形成的一类化合物，通常由10~100个氨基酸分子组成，其连接方式与蛋白质相同，相对分子质量低于10000，小编姑且称其为“小众蛋白”。多肽普遍存在于生物体内，迄今在生物体内发现的多肽已达数万种，其广泛参与和调节机体内各系统、器官、组织和细胞的功能活动，在生命活动中发挥重要作用。
小型蛋白的广阔舞台
近年多肽药物的研发、生产成本随着技术革新大幅下降，相关开发持续升温。据统计，多肽药物研发平均周期比化学药物少0.7年，成药性比例相对更高，且批准上市率也比小分子化药高约10%，故其研发风险和投入都明显优于化学药物。据不完全统计，从1970年开始，每年都有1个多肽药物进入临床，2011年有500~600个多肽处于临床前研究阶段，到2012年进入临床研究的多肽药物有128个，其中处于Ⅰ期临床研究阶段的有40个，Ⅱ期临床74个，Ⅲ期临床14个。2001-2012年间，有19个多肽药物在美国或欧洲首次获得批准，仅2012年就有6个新分子实体多肽药物在美国获准上市。
表1. 多肽药物与传统化药及蛋白质药物对比
目前，全球多肽药物市场规模已超过200亿美元，占医药品市场总份额的2%左右，且其增速保持在10%左右，随着这几年来多个多肽重磅品种专利到期，相关仿制药又必将如雨后春笋一样蓬勃发展。总体来看，国外多肽重磅药物主要集中于肿瘤、慢性病以及罕见病等领域，国内多肽药物主要集中于免疫辅助、胃肠道止血等领域（如胸腺五肽、生长抑素等）。
表2. 多肽重磅药物基本信息
据统计，全球上市的多肽药物呈逐年增加态势，近几年该市场复合增速达12%以上，显著高于整体药物市场。另据报道，我国多肽药物市场的年复合增长率远高于国际市场，可达24%以上，但从几家调研医院2014年的数据来看，国内多肽药物市场主要产品依然为进口产品所主导，进口企业销售额约为9.0亿元，国内企业销售额仅约为2.3亿元。
图1. 2005-2014年多肽药物市场增速（上：全球市场规模，下：国内市场销售额）
小型蛋白的获取途径
多肽药物的制备方式目前主要有生物合成、化学合成及动植物中提取。生物合成途径主要借助基因工程来实现，近年来经过科研工作者的不懈努力，我国基因工程“上游”技术与国外差距已日益缩小，但针对“下游”的蛋白质纯化处理技术依然与国外存在较大差距。化学合成途径中最重要的是组合化学在多肽制备中的应用，上世纪80年代组合化学以固相多肽合成为契机问世，该方法将氨基酸的构建单元通过组合方式进行连接，合成得到大量的化合物库，并对其进行高通量筛选以得到具有特定理化性质和药理活性的目标产物及异构体。提高对化合物库目标分子的快速分析检测、分离纯化能力是目前迫切需要解决的关键问题。此外多肽还可以从生物体内提取，但由于其体内含量甚微，提取纯度过低，严重限制了其临床应用和成药性。
多肽的基因工程生物合成实示意图
多肽的组合化学合成示意图
多肽药物企业最迫切的需求
“多肽”如此多娇，引无数“企业”“资本”竞折腰，但由于其两种主要合成方案都会不可避免的引入较多杂质，使得研发下游的分离纯化成本居高不下，这一直以来都是众多研究者的心病。面对日益严格规范的药品申报法规，俨然有谈“杂”色变之感，对于这一点小编也曾深有体会，但反观目前传统的纯化方案却大都存在如下缺憾：
下游分离纯化成本高昂，占总生产成本的60%-80%
传统填料因形貌粒径不均匀而受力不均，机械强度极差，重复装柱时反压升高，寿命短
不均一粒径的填料间存在不均匀间隙，样品极易流穿，动态载量显著降低
洗脱/收样不集中，流动相/缓冲液严重浪费，研发成本大幅升高
层析过程中容易发生色素沉积，影响柱效和分离纯度
作坊式生产的填料，批次间分离性能重现性差
去除内毒素或杂质过程中，填料耐碱性差，寿命受到限制，甚至无法纯化
传统填料稳定性差，易污染，清洗和再生难度较高，重复使用效果极差
现有填料对目标产物吸附明显，导致柱效降低、峰型变宽和拖尾等负面影响
UniRPC系列反相聚合物填料，您知道吗？
纳微科技的UniRPC系列反相聚合物色谱填料采用全球领先的专利技术，专门为工业规模分离有机化合物、天然产物、蛋白、多肽、核酸等所设计聚合物反相填料，特别是满足多肽药物企业最迫切的需求。采用单分散均一粒径，因其在耐碱性、长寿命与避免碱性化合物拖尾上有显著优势，与硅胶色谱填料在分离性能和溶剂兼容性形成优势互补，纳微科技可提供全球品种规格最多的单分散聚合物色谱填料类型，从亚微米UPLC填料、HPLC填料及到中低压FPLC填料，在实验室分析、生物制药、中药、化药、食品等领域得到广泛应用。
纳微聚合物反相色谱填料基本属性一览表
*动态载量：VA代表万古霉素，IN代表胰岛素
**对于特殊规格需求，提供专业化客户定制服务
UniPS反相聚合物填料两步纯化利拉鲁肽的工艺实例
多肽分为天然存在的（如激素、某些抗生素、人体内的脑啡肽、谷胱甘肽和细菌的毒素等）、重组多肽（如EGF）、合成多肽（如胸腺肽）、蛋白的多肽消化片段。下面介绍一个采用UniPS反相聚合物填料两步纯化多肽的实例：
*经两步纯化后，终产物纯度达标，且单杂含量在0.5%以下
许多国内外文献报道称，多肽在用硅胶反相填料纯化时，会因蛋白质在流动相中带有净电荷而与硅胶上的硅羟基结合，引起被纯化蛋白的峰型较差，如峰变宽、拖尾等负面影响，甚至会降低蛋白的回收率。因此，如果您在进行类似课题或项目实验时，我们建议可以选用完全封端和未封端的硅胶填料，尤其是尝试一下纳微科技的UniPS反相聚合物填料，相信可以筛选出最佳的工艺条件。
纳微反相聚合物填料助您技术攻关
小编搜集了一些采用纳微反相聚合物色谱填料的药物研发专利，分享如下：
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