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摘要：蛋白A（Protein A）层析，在大多数FDA提交的申请中，被用作单克隆抗体（mAb）的捕获步骤。本研究以载量、操作流速和产率（每升填料的mAb产率）作为指标研究整个发展历史中Protein A的表现，从而对一直使用Protein A的原因有所了解。自从1978年起，Protein A的产率和载量已分别以每年4.3%和5.5%的速率增长。相比而言，Protein A的操作流速在1978到2001有所增加，然后却维持不变或下降，因为流速的进一步提升仅能获得微小收益。Protein A填料产率和mAb生物反应器所获滴度（14%的增长）约自1990时开始迅速提升，从而给临床试验提供更为经济的材料。技术发展通常由产品销售所驱动。Protein A填料的销售，如Protein A配基销售（21%的增长）所示，几乎与mAbs的销售（20%增长）平行。两者在2000年首个重要的一类mAb治疗药物的获准上市并开发市场后均出现迅速的增长。还没有可替代Protein A层析的方法，因为Protein A性能具有数量级的优势。Protein A膜吸附和整体柱比装填柱的产率要高，这是因为它们具有短的柱床高度和高的操作流速。这些设备目前还未在大规模生产中实现，但可能代表了未来提高Protein A产率的一种形式。

简介

      从收获的细胞培养液中纯化mAb的标准工艺通常至少包括两步层析：Protein A亲和层析和离子交换层析。Protein A层析利用分子的Fc区与固化在层析基质上的Protein A配基之间的相互可逆作用，将蛋白与杂质分离。杂质经基质流穿，而mAb结合在柱上；层析柱随后淋洗去除另外的杂质；通过低pH从基质上洗脱产品。

      Protein A可以与人和兔血清抗体广泛结合的现象首次被Jensen所发现，其将这种结合归因于天然抗体对细菌抗原的特异性（antigen A）。随后，抗原被不正确地描述为细菌多糖，然后才被正确地显示为一种细菌细胞壁蛋白。该蛋白于1964年首次被称为Protein A，以区别于其他多糖和蛋白。

      随后，天然抗体对细菌抗原特异性的理论被证明是错误的。Protein A与抗体结合显示缺乏细菌抗原特异性，且能与抗体Fc区结合。另外显示Protein A与抗体Fc片段结合较与Fab区或轻链结合更紧密。后来，将Protein A固化在固体支撑物上用来进行抗体亲和层析的技术开发出来并申请了专利。Protein A填料在1978年首次实现商品化。

      Protein A可与一些不同种属的同型抗体结合。第一个治疗性抗体Orthoclone，于1986年批准上市，在纯化工艺中利用了Protein A层析作为捕获步骤。在随后的FDA申请中，86%的在mAb的捕获步骤使用Protein A。早期的Protein A填料价格昂贵且载量、流速和寿命均有限。有一些研究已经描述可使用其他纯化方法替代Protein A层析步骤。离子交换层析经常被讨论用来替代现有的mAb捕获策略。抗体或杂质沉淀或结晶也被推荐使用。也有提议用替代蛋白或合成分子的亲和填料取代Protein A。

      而自从1978年起，Protein A的性能和可用性获得稳步提升。具有更高刚性、更多孔隙；可获得高流速、低压力降和高mAb载量的新基球不断涌现。基球和孔隙尺寸经优化获得更佳性能。开发出了一些基球化合物用来提升Protein A性能，其中包括交联琼脂糖，可控孔度玻璃、聚乙烯-二乙烯基苯、陶瓷、聚甲基丙烯酸酯、交联纤维素和聚乙烯醚。

      Protein A得益于无动物源性材料。Protein A固化至基球技术的提高，如通过单个或多个点偶联，使得配基更易被接触和载量提高。Protein A域个数和域中氨基酸的改变，提高了Protein A的载量、使用寿命、耐腐蚀性、洗脱pH和单克隆抗体Fc特异性。这些改进使得每升Protein A填料每小时产出的mAb量（产率）增加。

      在本研究中，Protein A产率、载量和操作流速的增长是根据现有文献数据进行了追踪分析。比较后了解到Protein A层析的性能提高是多么迅速，该发展如何与生物反应器所获滴度的提高相比较。为了了解Protein A目前和潜在未来改进的时限和原因，将Protein A性能的提升与Protein A填料和治疗性mAb的销售增长做了比较。
 

Protein A发展回顾

      将可引用的研究所提供的Protein A柱床高度、流速和10%流穿载量数据进行了汇总，用来进行Protein A产率、载量和操作流速增长速率的评估。填料上市时间来自填料供应商或由最早公开发表的填料信息的日期评估。

      对已报载量所对应的流速（操作流速）进行了汇总，这里未对最大流速进行总结，因为一些研究中仅报道了最大压力，而其他一些研究提供了最大流速值却未同时提供相应的载量数据。

      Protein A填料的一些关键属性数据只有有限的数据可用。不幸的是，价格信息很少被供应商或客户公开，因此在本研究中未进行评估。在2015年Repligen年度报告中提到，全球Protein A介质市场每年产生的收入评估在3.0到4亿美元间。另外，所获得的填料使用寿命、非特异性产物和杂质吸附、配基脱落和可再生性的数据有限。

      通过选择性突变Protein A配基，使得Protein A配基的高pH稳定性得到提高。参考文献中的相关化学稳定性数据详见表1。基于持续暴露在特殊pH环境下一段时间后考虑，预期Protein A性能会有所降低，然而很少有参考文献提及。这导致化学稳定性改善速率难以测量。

      产率定义为一种Protein A填料每小时能纯化mAb的克数。大多数，但不是所有研究都提供了上样抗体的浓度。因此假设上样期间mAb的滴度为1g/L。假设淋洗、洗脱和再生步骤分别为10，3和5个柱体积（CV）。根据方程1所示，每个试验中的总CV数取决于报道的填料载量，假设的生物反应器所得滴度，淋洗CV数，洗脱CV数和再生CV数。

      Protein A性能数据的数量和质量存在差异。早期Protein A填料通常只有一个或几个低载量和/或低流速数据点。因此，不可能以单一流速为参考比较所有的填料，或以单一载量为参考比较流速。所以，用每个研究报道中所有流速下获得的数据，对产率、载量和操作流速的增长进行绘图和评估。一些供应商文献提供的试验数据有限，且可能选用了对自身产品有利的条件进行试验。有个研究利用了一种IgG3型抗体，可能会不利于其他一些填料的载量表现。上样抗体浓度从0.33到10mg/ml不等，有些研究都未报道该数据。高浓度已被报道可提高或不影响Protein A的载量。上样浓度1mg/ml被假设用来计算产率。研究中的柱床高度从2到30cm不等，低的柱床高度通常会表现出高的流速和产率。然而，低的柱床高度不太能代表mAb生产工艺，这会导致载量低。

      表 1 Protein A上市时间，柱床高度，操作流速，10%流穿时载量，产率，上样成分，和耐腐蚀性。产率定义为一种Protein A填料每小时生产时间内能纯化mAb的克数，生产时间包括上样、淋洗、洗脱和再生的时间。假定mAb的滴度为1g/L，淋洗、洗脱和再生的体积分别为10，3和5个柱体积，并通过填料载量和流速数据计算产率。

2.1. Protein A产率的提升

      如图1所示填料产率对上市时间作图。将除了膜吸附和整体柱数据外的所有数据点拟合至方程3，得到产率的复合年增长速率r为4.3±1.4%，初始值Y0为5.8±2.4g/L/hr。

      3. Y=Y0（1+r）t

      增长速率对假定的滴度有些敏感，但对各工艺步骤假定的CV不敏感。假设用0.1或10g/L，替代1g/L，将会使得增长速率变化至2.4±1.2%或7.7±1.8%。而将假设的淋洗、洗脱和再生的CV数翻倍，并不会改变产率增长速率，因为所有的数据变化程度相似。

2.2.  Protein A载量的增加

      如图2所示Protein A载量对时间作图，将除了膜吸附和整体柱数据外的所有数据点拟合至方程3，得到载量的复合年增长速率为5.5±1.2%，初始Y0为7.2±2.6g/L/hr

2.3. 操作流速的提高

       如图3所示操作流速对时间作图，与Protein A载量和产率相比，操作流速随着新的刚性和多孔率基球的出现，在1978年和2001年间出现了提高，随后保持稳定或降低。

2.4.  Protein A销售额的增长

      在文献或主要Protein A填料生产商：GE Healthcare，Millipore和Applied Biosystems的年报中，描述Protein A产量和销售增长的数据有限。然而，Repligen公司，给填料生产商提供Protein A配基的最大的供应商，在年报中提供了销售给GE Healthcare（最大的Protein A填料生产商）和Applied Biosystems的收入比例数据。另外，Repligen提供了2003-2011年期间Protein A配基总销售数据。这涵盖了所有用于生产填料、小规模研究和诊断目的的Protein A配基。对GE Healthcare的销售额从1999年的$318,000增长至2014年的$24,148,377，通过将GE Healthcare的销售数据拟合至方程3并绘图详见图4，得到销售的复合年增长率为21±2%，初始Y0为$1,300,000±390,000。这与Repligen在其2015年报中报道的配基销售增长速率超过20%相似。

      Repligen的年报中指出GE Healthcare，绝对意义上的最大的Protein A配基客户，主要采购Protein A配基用于填料生产。基于此，评估认为Protein A填料总销售额增长速率与Repligen卖给GE Healthcare的Protein A的销售额增长速率一致：在1999-2014年间年增长21%。

      如图5所示就Protein A产率、生物反应器所得mAb滴度、Protein A销售额和mAb的销售额的增长对时间进行了比较。分别在图1和图2中，最佳拟合Protein A产率和载量数据的增长曲线被绘制在图5中。年报中销售前五的mAbs（Avastin®, Humira®, Rituxan®, Remicade®, Herceptin®）和Enbrel®每年的销售额也加入绘制其中。Repligen卖给GE Healthcare的Protein A配基的销售额也绘制在图5中。

3. 讨论

产率、载量和操作流速的增长

      Protein A产率（图1）和载量（图2）自从1978年起稳步增长，且已经提高了一个数量级。人们相信Protein A产率和载量还将增长。两款最高性能的填料MabSelect SuReTM和Toyopreal® AF-rProtein A HC-650F已最近上市（分别在2011年和2013年），也预示着持续增长的情况。

      令人惊讶的是，操作流速从1978年到2001年有所增加，而随后保持稳定或下降（图3）。不低于1000cm/hr的操作流速首次在1993年报道，最近报道在2008年详见表1。可能因为当流速在1000cm/hr以上时，在Protein A步骤中仅能对整体花费时间有微弱改善。比如，在高流速下需要70分钟进行一轮Protein A循环（包括上样、淋洗、洗脱和再生步骤），假设柱床高度20cm，1000cm/hr的流速，40g/L的载量和1g/L的抗体滴度。设定在Protein A层析前后的收获和低pH病毒灭活步骤通常需要一小时以上，而现在的抗体滴度通常在1g/L以上，没有必要将Protein A层析循环时间降至70分钟以下。另外Protein A的流速也会受限于泵的能力。

      如果有报道中有多种流速的话，Protein A的最大产率往往出现在最高流速时。例如，mAb Select被报道称，在1500cm/hr时的载量为10g/L；在600cm/hr时的载量为20g/L。较高流速条件下在g/L/hr的基础上有更高的产率，但在生产工艺中不太可能接受10g/L的载量。

      图2中有趣的是推断Protein A载量的理论极限。已报道阳离子交换层析载量约200g/L。生产具有高密度的和适当取向的配体的阳离子交换填料比Protein A填料容易很多。然而，Protein A填料的载量似仍在增长。将来Protein A配基的尺寸很可能会通过去除所有非结构、表达或结合所必须的氨基酸残基而进一步减小。更多的孔隙但结构更具刚性的基球，也将增加配基固定化和mAb结合的可用空间。

      Protein A整体柱和膜吸附可在比填充柱更高的流速和更短的柱床上操作，因此具有更高的产率。它们存在一些缺陷而阻止了其在生产中的使用。目前仅可达8ml规模，且载量低（在本研究中2.7-10g/L），因此稀释了洗脱峰。例如，若3个柱体积用来洗脱，收得的洗脱样品浓度将在1-3g/L间。在Protein A膜吸附层析上样中，有报道称出现mAb流穿。尽管它们存在这些缺点，在本研究中依然因其潜力而进行了评估。它们可能代表了未来Protein A产率提高的一种型式。保留时间、Protein A膜吸附和整体柱层析的循环次数比那些利用多根柱进行层析操作的循环次数要少很多。

在mAb工业化背景下的Protein A性能的提高

      考虑Protein A生产力的提高的原因和与其他工艺作比较是非常有趣的。在62个不同技术工业领域中的技术改进均被描述与该工业的积累性产品增长密切有关。既然Protein A填料主要用来生产mAbs，Protein A生产力的增长将于mAb工业发展相关。销量最高的五个抗体产品和Enbrel的平均复合年增长速率在2004-2013年期间为20%。Protein A的销售（此处评估为21%）增长比报道的其他高级层析填料的（5.8%）要高，但与mAb产业的销售额增长速率（20%）相当。这点毫不奇怪，因为Protein A填料就是用于mAb生产的。

      抗体和Protein A填料销售额比较的困难在于mAb的收入增长一部分因为更高的药价，这与Protein A使用的增加无关。这个可能会被Protein A填料用于制造临床抗体而不产生mAb收益抵消。

      本研究中，生物反应器所得mAb的滴度从1987年的500mg/L增加至2006年的5g/L，年增长速率为14%。在其他研究中，滴度从1985年的0.2g/L增加至2015年的2.64g/L，年增长速率也是14%，比Protein A产率增长速率（4.3%）高。这个差别并不奇怪，因为滴度和生物反应器能力的限制威胁到了治疗mAb工业早期的发展。而Protein A的产率限制从未威胁到mAb工艺的发展，也未需要大型的开发投资。另外，约从2000年起，Protein A销售收入已经远低于mAb的销售收入（图5）。因此，Protein A供应商可用于产品改进的经济来源远低于mAb生产商可用来提升生物反应器所获滴度的经济来源。

      注意到图5中，Protein A产率和mAb滴度均在约1990年开始迅速增长，且mAb滴度增长快于Protein A产率。这与最高销量的mAbs开始早期临床研究的时间一致。Protein A和治疗mAbs的销售额在约十年后的2000年开始迅速增长。该间隙约与进行所有临床试验、获得监管批准和开发mAb市场所需时间一致。生物反应器所获滴度的增加与Protein A性能的提升发生在销售额增长之前，表明在研发阶段的投资，存在着未来销售强劲的假定风险。

4.结论

      自从首个治疗性抗体获批，用于mAb纯化的系列步骤至今未变，Protein A的性能，如载量、操作流速和产率等指标在稳步提升。Protein A产率和载量自1978年起分别以每年4.3%和5.5%的速率增长且很可能会继续增长。部分因为基球刚性、尺寸、聚合物和孔隙结构的改进所致。另外，配基固定化技术、Protein A结构域数目和Protein A氨基酸序列的改变也导致性能的提升。

      相反的，Protein A操作流速在1978年和2001年间有所提高，而随后保持稳定或降低，因为进一步的提升仅产生微小的效益。Protein A填料的产率在约1990年开始迅速提升，与生物反应器所获滴度的提升平行，滴度的提升使得可以更为经济地为临床试验提供材料。Protein A填料的销售额增长，如Protein A配基销售额（21%）增长所示，与mAbs销售额（20%）的增长几乎平行。在2000年首个主要类别的mAbs获批和市场开发后，Protein A和mAbs的销售额都出现了迅速增长。因为Protein A性能的稳定提升，似乎使得许多已经开发用来替代Protein A层析的方法至今未能实现实际应用。Protein A膜吸附和整体柱比填充柱具有更高的产率，因为它们具有更短的柱床高度和更高的操作流速。这些目前还无法在大规模生产中实际应用，但可能代表了种未来提升Protein A产率的一种形式。

图片说明

图1：Protein A填料产率与上市时间关系图。产率由Protein A填料在上样（假设1g/L的滴度）、淋洗（10CV）、洗脱（3CV）和再生（5CV）所需的时间内纯化的抗体质量决定。数据用实线（当同一年有两个研究数据时分别用实线和虚线）连接，用来研究在不同流速下的产率。通过将除了膜吸附和整体柱外的所有数据拟合至方程3中，得到产率的复合年增长速率为4.3±1.4%，起始值Y0为5.8±2.4g/L/hr。填料数据用¢表示，膜吸附和整体柱用Ï表示。

图2：Protein A在10%流穿时的载量与上市时间关系图。数据用实线（当同一年有两个研究数据时分别用实线和虚线）连接，用来研究不同流速下的载量。通过将除了膜吸附和整体柱外的所有数据拟合至方程3中，得到产率的复合年增长速率为5.5±1.2%，起始值Y0为7.2±2.6g/L/hr。填料数据用¢表示，膜吸附和整体柱用Ï表示。

图3：Protein A操作流速（报道载量数据中的流速）与上市时间关系图。数据用实线（当同一年有两个研究数据时分别用实线和虚线）连接，用来研究不同流速。填料数据用¢表示，膜吸附和整体柱用Ï表示。

图4：Repligen Protein A配基的销售额图。将销售给GE Healthcare的数据拟合至方程3，得到销售额的复合年增长速率为21±2%，起始值Y0为$1,300,000±390,000。虽然里面含有用于小规模研究和诊断用途的配基销售额，Repligen的年报中指出GE Healthcare主要采购Protein A配基用于填料生产。

图5：Protein A产量、载量、销售额、mAb滴度和mAb销售额与时间关系图。mAb销售额由销售前五的mAbs（Avastin®, Humira®, Rituxan®, Remicade®, Herceptin®）和Enbrel®每年的销售额决定。增长曲线与绘制在内的图1的Protein A产率和图2的Protein A载量数据曲线非常吻合。Repligen卖给GE Healthcare的Protein A配基销售额数据也绘制在内。

参考文献：
Bolton GR, Mehta KK.The role of more than 40 years of improvement in protein A chromatography in the growth of the therapeutic antibody industry. Biotechnol Prog. 2016 Sep;32(5):1193-1202.