亲和层析纯化抗体时如何减少洗脱后中和沉淀的出现
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- 发布时间：2023-02-18 09:32
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随着亲和层析技术的发展，蛋白质纯化技术相对简单，蛋白质纯化技术的应用也越来越普遍，亲和层析可以达到90%以上的纯度。但是，蛋白质纯化过程中的每一个环节都不容忽视。样品处理、净化介质的选择、净化方法的考虑等。虽然纯化方法简单，但是蛋白质不同，采用的纯化体系也不一样。只要达到终的净化目的，就是好的净化方法。
亲和层析纯化抗体时如何减少洗脱后中和沉淀的出现
随着亲和层析技术的发展，蛋白质纯化技术相对简单，蛋白质纯化技术的应用也越来越普遍，亲和层析可以达到90%以上的纯度。但是，蛋白质纯化过程中的每一个环节都不容忽视。样品处理、净化介质的选择、净化方法的考虑等。虽然纯化方法简单，但是蛋白质不同，采用的纯化体系也不一样。只要达到终的净化目的，就是好的净化方法。
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随着亲和层析技术的发展，蛋白质纯化技术相对简单，蛋白质纯化技术的应用也越来越普遍，亲和层析可以达到90%以上的纯度。但是，蛋白质纯化过程中的每一个环节都不容忽视。样品处理、净化介质的选择、净化方法的考虑等。虽然纯化方法简单，但是蛋白质不同，采用的纯化体系也不一样。只要达到终的净化目的，就是好的净化方法。
对于亲和层析纯化的抗体，无论是蛋白A/G还是特异性抗原亲和层析，一般在酸洗脱峰后加入。因为蛋白质长时间在酸性条件下容易水解。但问题是中和容易产生沉淀。这是为什么呢?怎么才能避免这种情况呢?
这种沉淀主要是由于洗脱过程中酸性条件导致抗体变形，pH的剧烈变化更容易导致中和过程中抗体变性。沉淀的另一个重要原因是宿主蛋白等杂质含量高。这类杂质很容易导致中和时溶液浑浊，进而导致抗体沉淀。
减少亲和层析沉淀的发生，应该从几个方面着手：
(1)尽量提高洗脱液的pH值。了解蛋白质pH值的稳定性，包括在低pH值下的稳定性，以及抗体的溶解性。如果pH稳定性较低，使用探索高PH洗脱(PH5.0、4.0、3.0)，都可以尝试。高ph可以洗脱，尽量不要选择较低的PH。
(2)尽量减少宿主蛋白。亲和层析前可通过深度过滤、絮凝沉淀、超滤等方法去除部分宿主蛋白杂质。此外，亲和层析中的中间洗涤步骤被优化以去除尽可能多的宿主蛋白。当然，不同批次的料液中宿主蛋白的含量是不一样，所以在亲和层析前需要加强监控，控制料液中HCP的含量。装后好加wash洗HCP，加添加剂wash在PH 6时更换)。另外，介质本身也存在一些HCP的非特异性吸附。
(3)同时可以加入尿素等一些变性剂，提高洗脱液的洗脱能力;也可以加入蛋白质稳定剂如精氨酸以减少蛋白质变形;也可以改进中和条件，用于中和的溶液的浓度和剂量不应太高。如果是溶解度低的蛋白质，适当减少亲和层析的样本量;在样品处理和净化过程中，尽量保持低温(4-8)。
(4)一般纯化后的蛋白，无论是溶液还是冻干，都需要加入甘油或酒精，糖作为蛋白稳定性的保护剂，避免沉淀。
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