亲和层析常见问题解决方案汇总
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- 发布时间:2022-12-30 10:25
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亲和层析主要依靠蛋白质与介质配体之间的特异性可逆结合进行分离。配体可以直接与目标蛋白结合,也可以与共价连接到蛋白质上的标签结合。亲和层析通常是广泛的纯化过程。一般用于纯化过程的前期,快速从样品中捕获目标物质。根据后续应用的需要,可能只需要一步亲和层析,获得纯度可接受的蛋白质。
亲和层析常见问题解决方案汇总
亲和层析主要依靠蛋白质与介质配体之间的特异性可逆结合进行分离。配体可以直接与目标蛋白结合,也可以与共价连接到蛋白质上的标签结合。亲和层析通常是广泛的纯化过程。一般用于纯化过程的前期,快速从样品中捕获目标物质。根据后续应用的需要,可能只需要一步亲和层析,获得纯度可接受的蛋白质。
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亲和层析主要依靠蛋白质与介质配体之间的特异性可逆结合进行分离。配体可以直接与目标蛋白结合,也可以与共价连接到蛋白质上的标签结合。亲和层析通常是广泛的纯化过程。一般用于纯化过程的前期,快速从样品中捕获目标物质。根据后续应用的需要,可能只需要一步亲和层析,获得纯度可接受的蛋白质。下面了解下亲和层析常见问题解决方案汇总。
蛋白质和亲和层析不结合
Q:标签未翻译或标签包裹在结构中
A:检查质粒序列或将标签移到另一个位置。当标签被移动到另一个位置并被包裹在结构内部时,标签必须暴露出来(例如用尿素变性,但尿素变性后只有部分标签蛋白可以与亲和填料结合)。His标签蛋白和金属螯合介质,但GST标签和GST介质无法亲和结合。
Q:结合缓冲液不合适,柱子平衡不好
A:调整缓冲液,例如金属螯合介质与His-tagged蛋白结合时,pH值应在7.3-8.5之间。肝素亲和介质与DNA聚合酶结合时,盐浓度过高影响结合,应控制在50mM以下。色谱柱平衡不好。柱床系统中的环境也会影响结合。色谱柱在上样前必须完全平衡。
Q:没有足够的时间结合
A:降低样品的流速,使蛋白质和介质之间有足够的接触时间。
Q:层析介质选择不当
A:亲和介质被分类,一类特异性结合蛋白质,另一类特异性结合一类蛋白质。例如,蛋白质培养基结合一种蛋白质,而肝素培养基结合一种蛋白质。
Q:白与介质结合力太强
A:增加洗脱强度,如他蛋白与镍柱的结合,可以增加取代基咪唑的浓度。
Q:蛋白质聚集在柱子上
A:通过调整层析过程中的缓冲液来增加蛋白质的稳定性,改善蛋白质在层析柱上的状态。当堆积在层析柱上时,需要用CIP清洗层析柱。
Q:柱床未完全冲洗
A:上样后,应充分冲洗柱床,将未结合的介质留在介质颗粒的空隙中,将孔中的蛋白质洗出,然后洗脱。
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